Para se produzir organismos transgénicos recorre-se a vários métodos e técnicas de obtenção.
Métodos:
- Método de bombardeamento: Segundo o método de bombardeamento, micropartículas de um metal (tungstênio ou ouro) são revestidas por fragmentos de DNA contendo os genes selecionados. Através de um aparelho ("canhão de genes"), as partículas são aceleradas a altas velocidades e bombardeiam o tecido vegetal que vai sofrer a transformação. As partículas penetram nas células e libertam os fragmentos de DNA. As células da planta assimilam os genes e alguns passam a integrar o genoma.
- Método de infecção por bactérias: O método de infecção por bactérias, em vez do bombardeamento de genes, usa bactérias para infectar a planta a ser modificada e transportar os novos genes para o seu genoma. O que os cientistas fazem é substituir os genes infectados, que ficam no plasmídeo Ti (T-DNA) da bactéria, pelos genes selecionados. Células de embriões da planta que se quer modificar são colocadas em contato com uma suspensão contendo as agrobactérias (são bactérias do solo com capacidade de se associarem espontaneamente a algumas plantas e transferir naturalmente alguns dos seus genes para elas). Ao infectar os embriões, elas transferem para o genoma da nova planta os genes com as instruções para dar as características desejadas.
- Regeneração das plantas a partir de células transformadas: Uma vez inserido o gene na célula vegetal, por um dos métodos mencionados acima, esta célula ou grupos delas são estimuladas a gerar uma planta transformada.
A transformação de uma célula vegetal é um tipo de manipulação genética que atende ao mesmo princípio da transformação de microrganismos, estabelecido pela primeira vez em 1973, quando Stanley e Cohen, em São Francisco, introduziram o gene proveniente de uma rã numa bactéria. No entanto, há diferenças conceituais entre a situação com microrganismos e com plantas: nos primeiros, os objetivos finais são mudanças operadas no nível celular, enquanto que em eucariotos superiores, como plantas e animais, as mudanças obtidas no nível celular não são significativas, a não ser que possam ser transferidas para todas as células do organismo. Ou seja, o domínio das técnicas de regeneração de plantas inteiras a partir de uma única célula é condição fundamental na biotecnologia aplicada para a agricultura. E como cada espécie de planta tem diferentes exigências hormonais, nutricionais e ambientais para a regeneração, esta etapa ainda representa o maior fluxo na criação de plantas transgênicas, embora esta técnica já esteja estabelecida para inúmeras plantas de interesse económico.
Métodos:
- Método de bombardeamento: Segundo o método de bombardeamento, micropartículas de um metal (tungstênio ou ouro) são revestidas por fragmentos de DNA contendo os genes selecionados. Através de um aparelho ("canhão de genes"), as partículas são aceleradas a altas velocidades e bombardeiam o tecido vegetal que vai sofrer a transformação. As partículas penetram nas células e libertam os fragmentos de DNA. As células da planta assimilam os genes e alguns passam a integrar o genoma.
- Método de infecção por bactérias: O método de infecção por bactérias, em vez do bombardeamento de genes, usa bactérias para infectar a planta a ser modificada e transportar os novos genes para o seu genoma. O que os cientistas fazem é substituir os genes infectados, que ficam no plasmídeo Ti (T-DNA) da bactéria, pelos genes selecionados. Células de embriões da planta que se quer modificar são colocadas em contato com uma suspensão contendo as agrobactérias (são bactérias do solo com capacidade de se associarem espontaneamente a algumas plantas e transferir naturalmente alguns dos seus genes para elas). Ao infectar os embriões, elas transferem para o genoma da nova planta os genes com as instruções para dar as características desejadas.
- Regeneração das plantas a partir de células transformadas: Uma vez inserido o gene na célula vegetal, por um dos métodos mencionados acima, esta célula ou grupos delas são estimuladas a gerar uma planta transformada.
A transformação de uma célula vegetal é um tipo de manipulação genética que atende ao mesmo princípio da transformação de microrganismos, estabelecido pela primeira vez em 1973, quando Stanley e Cohen, em São Francisco, introduziram o gene proveniente de uma rã numa bactéria. No entanto, há diferenças conceituais entre a situação com microrganismos e com plantas: nos primeiros, os objetivos finais são mudanças operadas no nível celular, enquanto que em eucariotos superiores, como plantas e animais, as mudanças obtidas no nível celular não são significativas, a não ser que possam ser transferidas para todas as células do organismo. Ou seja, o domínio das técnicas de regeneração de plantas inteiras a partir de uma única célula é condição fundamental na biotecnologia aplicada para a agricultura. E como cada espécie de planta tem diferentes exigências hormonais, nutricionais e ambientais para a regeneração, esta etapa ainda representa o maior fluxo na criação de plantas transgênicas, embora esta técnica já esteja estabelecida para inúmeras plantas de interesse económico.
De seguida, encontram-se as Técnicas!
Técnicas:
Para explicarmos as técnicas utilizadas na produção de organismo geneticamente modificados, começamos por explicar a técnica do DNA recombinante.
- Técnica do DNA recombinante: O isolamento dos genes de interesse é conduzido por meio de técnicas de clonagem molecular que consiste em induzir um organismo e amplificar a sequência de DNA de interesse, em sistemas que permitem uma fácil purificação e recuperação do referido fragmento de DNA. Para isso, são utilizados vectores de clonagem (plasmídeos ou vírus) nos quais a sequência de DNA de interesse é inserida , utilizando a enzima DNA ligase. Quando necessário, o fragmento de DNA de interesse pode ser libertado do vector por meio de enzimas de restrição. Uma vez isolado o gene de interesse, estes fragmentos de DNA (genes) são incorporados (por meio das técnicas de Engenharia Genética) no Genoma do organismo alvo, resultando daí um organismo geneticamente modificado (OGM), cuja característica adquirida passa a ser hereditária.
A tecnologia do DNA Recombinante foi desenvolvida em 1973 e permite a transferência do material genético de um organismo para o outro de forma efetiva e eficiente. Ao invés de promover o cruzamento entre organismos relacionados para obter uma característica desejada, os cientistas podem identificar e inserir, no genoma de um determinado organismo, um único gene responsável pela característica em particular. O gene inserido artificial ou intencionalmente no genoma de um organismo é denominado transgene. Desta forma, tem-se uma alteração precisa e previsível.
Antes do desenvolvimento da tecnologia do DNA Recombinante, a técnica utilizada era a do Melhoramento Clássico, na qual a transferência de genes se dava por meio de cruzamentos (reprodução sexuada), misturando todo o conjunto de genes dos dois organismos em combinações aleatórias. A técnica exigia um enorme gasto de tempo e não era precisa.
Expliquemos agora as restantes técnicas utilizadas na obtenção destes organismos.
- Electroporação de protoplastos e células vegetais: Protoplastos são células vegetais, desprovidas de parede celular. Para a transformação, são incubados em soluções que contêm os genes a serem transferidos e, em seguida, um choque eléctrico de alta voltagem é aplicado por curtíssimo tempo. O choque causa uma alteração da membrana celular, o que permite a penetração e eventual integração dos genes no genoma.
- Biobalística: Técnica introduzida no início da década de oitenta. Baseia-se na utilização de microprojécteis de ouro ou tungstênio cobertos com os genes de interesse. Os microprojécteis são acelerados com pólvora ou gás em direcção aos alvos que, neste caso, são os tecidos vegetais. Os genes e o projéctil entram nas células juntos de maneira não-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é dissociado das micropartículas pela acção do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado. A velocidade alcançada pelos microprojécteis atinge cerca de 1500 Km/h.
Uma das vantagens do sistema é que este permite a introdução e expressão génica em qualquer tipo de célula. Assim, foi permitida a transformação in situ de células diferenciadas sem necessidade de regeneração.
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